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奶牛胚胎移植技术的产业化前景

发布时间: 2012-11-02 14:15:27   作者:本站编辑   来源: 本站原创   浏览次数:  

 上个世纪六十年代以来,生物技术领域取得了前所未有的成就。由于数、理、化基础理论和实验技术的发展与广泛应用,推动了生物科学从微观世界(从细胞水平到分子水平)来研究复杂的生命现象。与此同时,生物技术领域的成就促进了应用科学的发展,从而推动和促进了农牧业、食品工业、医药工业的全面发展,对人类社会产生了巨大影响。
    动物胚胎工程技术是生命科学研究的基础,是现代生物工程技术的重要组成部分,属细胞工程范畴;系指对精子、卵子和胚胎的操作技术。研究内容包括胚胎移植、排卵控制、体外受精、性别鉴别、克隆技术、胚胎干细胞、胚胎嵌合、转基因技术以及显微受精等等。当前,动物胚胎工程技术的成就已广泛应用于畜牧业生产,并取得巨大的经济效益与社会效益。在我国牛、羊的胚胎移植技术已开始进入产业化应用阶段。
由于动物胚胎工程技术涉及的面很广,本文只能就当前有关奶牛胚胎移植技术产业化应用前景及相关的胚胎工程技术的几个方面,谈些粗浅的看法,仅供参考。
    1 胚胎移植技术的发展与应用
    1.1 国外发展概况
    从上个世纪的五十年代中期到七十年代末,胚胎移植技术研究从小动物向家畜发展,并取得实质性进展。1951年美国科学家Willett等获得牛胚胎移植成功,直到1964年日本的杉江、Mutter等完成了世界首例非手术牛胚胎移植犊牛,才开始获得快速的发展。1976年牛的非手术冲卵和移植方法开始应用, 到1980年非手术方法日臻完善,从此胚胎移植作为一项家畜改良和繁殖技术从肉牛应用到奶牛。并在1975年初在美国科罗拉多州召开了第一届国际学会成立大会的推动下,以及1976年年非手术移植技术的推广应用,牛胚胎移植技术的发展很快,1977年胚胎移植技术进入商业化应用。根据国际胚胎移植协会(IETS)的统计,近十年世界胚胎移植呈上升趋势,由1992年的282654头,上升到上世纪末(1999)的520712头,2001年由各国口蹄疫爆发,降至452546头,2002年达到538312头。
    自1997年至2002年,全世界历年超排处理供体牛,分别为82307头、96177头、119164头、113056头、101291头和101665头;平均获可用胚从5.9枚增至6.2枚。2002年各大洲体内胚胎生产情况见表1,总计生产胚胎538312枚,其中鲜胚占48%,冻胚占52%。
    2002年,美国生产牛胚胎17余万枚,平均每头供体牛获可用胚7.5枚,其中肉牛胚胎占58%,奶牛占42%。鲜胚占34.7%,冻胚占65.3%;移植后的总平均受胎率分别达到62.7%和50%,IVF胚胎受胎率达50%。出口胚胎6674枚(肉牛胚胎占52%,奶牛占48%)。
    2001年,根据加拿大60个单位的统计,共处理供体牛14380头;其中奶牛10893头(76%)、肉牛头(24%)。生产胚胎91927枚(奶牛67981枚、肉牛23946枚)平均为6.4枚/次;其中,生产冻胚62008枚(奶牛44381枚、肉牛17627枚)。鲜胚移植23613头,总受胎率为60.8%;其中,移植奶牛20025头次,受胎率为60.2%,肉牛3588头次,受胎率为64% 。冻胚移植23244头次总受胎率为59.7%;其中,奶牛15665头次,受胎率为59.9%,肉牛7579头次,受胎率为59.1%。移植早期性别鉴别胚胎3691头次,其中,奶牛2511头次,受胎率为59.3%,肉牛1180头次,受胎率为57.5%。2002年,加拿大超排处理供体牛14427头,其中奶牛占78.48%,肉牛占21.52%,共生产胚胎95298枚,每头供体平均产胚胎6.6枚。胚胎冷冻62312枚;移植鲜胚27135枚、冻胚27511枚。性别鉴别鲜胚2433枚、性别鉴别冻胚胎1180枚,出口胚胎13664枚(中国占60.3%)。
    1.2 国内发展概况
    我国的奶牛胚胎技术工作起步较晚,1978年在奶牛上取得手术移植成功,1980年非手术移植成功,1982年冷冻胚胎移植成功。上个世纪八十年代以来,20几个省区近三十个单位开展牛胚胎移植的研究工作。由于当时缺乏必要的仪器设备,特别是国产的激素质量不过关,加上技术不熟练,其结果是造成很多财力、物力的浪费,进展不大。为此,有关部门先后在西安(1983)、南昌(1985)、唐山(1986)和北京(1988)召开了四次全国性牛胚胎移植技术座谈会和研讨会,从而进一步推动了我国胚胎移植技术的发展。
直到1991—1995年间,全国年超排处理供体牛300—500头,移植1000余头。“八五”期间1996—2000年间,国家设立攻关项目“奶牛MOET育种核心群的建立”,由北京奶协主持,中国农业大学、中国农业科学院畜牧所和新疆畜牧科学院共同完成。该项目累计处理供体牛278头,平均获可用胚6.3枚,移植1214头次,总妊娠率为54%;鲜胚最高为70%(240/343)、冻胚为53%(133/251)。
    “九五”期间(1996—2000)牛胚胎移植技术研究分别列入国家攻关、863计划和农业部重大项目。由中国农科院畜牧所等单位承担的国家攻关项目。五年来,累计超排处理供体肉牛545头,平均可用胚为5.6枚;处理奶牛827头,平均可用胚为5.9枚。肉牛胚胎移植4971头次、奶牛3964头次,妊娠率分别为51.3%和51.5%;内蒙古家畜改良工作站,从加拿大进口胚胎3000枚,并处理安格斯、海福特肉牛435头,平均获可用胚为5.15~6.78枚;该站在1992—1999年累计移植受体牛4862头次,总妊娠率为47.84%;内蒙古大学与广西大学合作,生产牛的体外受精胚胎。据石德顺教授提供的资料,累计移植近1500枚体外受精胚胎,总妊娠率在25.5%以上;其中,鲜胚移植最高妊娠率达58.3%(54/96)。
    新疆自1985年至以来,先后承担国家攻关和863计划项目,并于1988年组建了“新疆家畜生物工程实验中心”。十余年来,累计处理供体牛近6000头次,生产胚胎3.5万余枚,移植受体牛近2.5万头次,已推广到全疆45个县;并与国内15个省区有技术合作关系。其中,承担的国家863产业化中试项目(1998—2000):三年累计处理供体牛2233头,生产胚胎12727枚,可用胚平均为5.7枚;鲜胚移植1147头、冻胚8255头,妊娠率分别为62.25%和52.59%。目前新疆有新疆胚胎工程技术中心、新疆金牛生物技术股份公司以及新疆天康生物技术股份公司为主的三家企业,从事胚胎生产和胚胎移植服务工作,累计年产奶牛胚胎2~2.5万枚,胚胎已销售至全国25个省区,并在全国16个省区及全新疆45个县市开展胚胎移植的服务工作。 

  “十五”期间(2001—2005),奶牛胚胎移植技术作为奶牛快速发展的配套技术,已列入国家重大奶业专项和863计划现代农业生物技术的攻关项目。承担单位有新疆动物胚胎生物工程技术研究中心、北京奶牛中心、内蒙古家畜改良站,以及西北农林科技大学和中国农科院畜牧所等单位。
    此外,自“九五”以来,从事奶牛胚胎生产、胚胎移植技术服务以及经营各种配套仪器设备、试剂、药品的企业纷纷诞生;国外的响应企业也看好我国这个巨大的市场,呈现出一遍繁荣景象。
    2 目前还存在影响我国牛胚胎移植技术快速发展的几个主要问题
    2.1 胚胎移植是充分发挥优良母畜的繁殖潜力,提高繁殖效力的新技术
因此,胚胎生产的规模决定于作供体的优良母畜的数量,由于我国优质良种母畜的不足,制约了良种奶牛胚胎的生产;
    2.2 胚胎移植是多项生物技术综合应用的繁殖新技术,它远比人工授精复杂
需要掌握一定理论基础和实践经验的人才能胜任,而目前我国胚胎移植技术熟练的人员严重缺乏,成为影响胚胎移植技术产业化的另一个重要瓶颈;
    2.3 胚胎移植是多项技术环节构成的复杂细致的系统工程,一个环节出问题,就将前功尽弃。如受体牛的品质(健康、营养等)以及大面积移植时受体牛发情观察的正确性,都将成为影响胚胎移植成败;
    2.4进行胚胎移植的费用高,这是制约大面积推广应用和产业化的另一个因素
胚胎移植的成本主要由供体牛的饲养管理、人力以及药品、试剂和必要的仪器设备构成;一般情况下供体牛与人力要占到成本的70%,其它占30%;此外,进行胚胎移植所需的药品、试剂和必要的仪器设备,几乎全靠进口,也是造成其成本高的另一个因素;
    2.5目前国内胚胎移植的市场很不规范,对进行胚胎移植技术服务的企业没有明确的要求一些技术力量不具备的企业也纷纷上马,甚至用质量不高的母畜来作供体生产胚胎等等,这些都将对胚胎移植技术产业化的键康发展带来不利影响。
    3 我国奶牛胚胎移植技术的发展前景
    我国是个养牛大国,居世界第三位。2002年末,有存栏牛13084.8万头,其中:黄牛9644.5万头、奶牛687.3万头、水牛2272.4万头。在687.3万头奶牛,纯种及高代杂种荷斯坦牛仅为150余万头,年产牛奶1299.78万吨;按奶牛总数计算平均每头年产奶1891.11千克,成母牛为3500千克;全国牛奶人均占有量不到10千克。 
    目前,我国正处在由传统农业向现代农业产业化体系的过度阶段,而实现畜牧业的良种化是农业现代化的重要环节。我国是世界养牛大国,而奶牛不仅数量少、生产水平低,远不能满足人民生活水平及农业现代化发展的需要,特别是我国加入“WTO”以后,保护本身的利益特别重要。所以,改造我国养牛业现状的任务极为重要,需要大量的良种牛来改良土种牛,通过杂交改良的速度很慢;依靠进口种畜需要大量外汇。为此,国家农业部在发展规划中指出:“建立良种繁育体系,保存、培育和提高我国地方优良牛种,推广应用引进优良品种,逐步形成优势牛种的繁育体系”。同时指出,“改进引种方式,鼓励引进冻精和胚胎,利用胚胎移植、胚胎分割等先进生物技术,加快繁育改良步伐。”
    综上所述,奶牛胚胎移植技术在我国已日趋完善,它的扩大应用定将在促进我国奶牛业发展中起到积极的推动作用。
    4 胚移植胎技术的应用发展前景
    4.1 体外受精技术
    哺乳动物的正常受精和生殖过程是在自身生殖道内完成的。胚胎移植技术就是利用这个原理,采用外源激素通过超数排卵技术,从供体体内获得数倍于正常生殖所产生的胚胎;而哺乳动物的体外受精是指受精过程中的精卵结合在体外的环境下完成的。
    早在1878年德国科学家Sehenk就开始将体内成熟的家兔、豚鼠卵子与附睾精子放入子宫液中培养,观察到第二极体的排出和卵裂现象。直到上个世纪五十年代初,华人科学家张明觉与澳大利亚科学家Austin同时发现精子的获能(Capacitation)现象,从此开创了哺乳动物体外受精技术研究的新纪元。1959年张明觉成功地获世界上第一只体外受精兔,从此哺乳动物体外受精技术才被人们接受。此后,二十余年先后在10余种动物获得成功。特别是牛的体外受精技术,自1982年美国科学家Brackett等获首例体内成熟卵母细胞经体外受精得到的犊牛之后,1986年和1988年分别报道了完全体外化的试管牛诞生。目前,牛体外生产胚胎的方法已较完整的建立起来,并开始进入商业化运作。
    我国哺乳动物体外受精技术的研究起步较晚,但进展较快,已先后在人和7种动物上取得成功。特别是人和牛的体外受精技术的研究已达到国际先进水平,每年约有近千例试管婴儿诞生,数百头体外受精犊牛出生。 
    在未来生命科学和畜牧业的发展中,配子与胚胎生物技术的应用具有举足轻重的作用。体外受精技术包含从配子的发生、体外培养、受精,直至生命的形成。所以,体外受精技术是生命科学研究的基础,也是扩大良种畜胚胎来源的一种主要手段。由于从屠宰场收集卵巢,通过体外受精技术,生产大量的廉价胚胎,降低了胚胎的生产成本,为胚胎移植技术的大面积推广创造了条件。鉴于目前我国没有大规模的良种畜可屠宰,以及体外生产胚胎移植后的成功率不高等因素,今后应该结合活体采卵技术,反复从良种母畜体内采集卵母细胞来生产体外受精胚胎。同时,应该进一步研究提高体外受精胚胎的囊胚率,解决妊娠率不高等技术问题。
    体外受精技术不仅仅限于扩大胚胎生产,就整个配子与胚胎生物技术的发展而言,它将成为胚胎生物技术的最基本的核心关键技术。所以,随着体外受精技术和配套技术的不断完善,其应用前景十分广阔。
    4.2 性别控制
    自古以来,人类对控制自身和动物后代的性别有极大兴趣。早在2500年以前,古希腊的科学家就认为,右侧睾丸产生的精子的后代为雄性,左侧为雌性;也有认为左右两侧子宫角产生不同性别的后代。当时,受“迷信学说”的影响,对性别的认识可以说是稀奇古怪、五花八门。直到1902年McClung在研究蝗虫精细胞时,首先提出了染色体决定性别的理论。1959年Welshons和Jacobs等提出Y染色体决定雄性的理论,1966年Jacobs等又发现雄性决定因子位于Y染色体的短臂上。1989年,Palmer等在Y染色体的短臂上找到了性别决定区(SRY),并得出不同动物间有很强的同源性。SRY序列的发现是二十世纪生命科学的重大成果之一,为人类最终完成哺乳动物性别控制这一历史性任务奠定了理论基础。 

 目前哺乳动物性别控制的方法很多,但最主要的方法是通过分离X、Y精子和鉴别早期胚胎性别的方法来达到控制后代性别的目的。 
    4.2.1 X、Y精子的分离。在受精前对精子性别的选择是性别控制最理想的途径,因此人们对X、Y精子的分离产生浓厚的兴趣,分离方法也多种多样。当前最有效的方法是借助流式细胞分离仪。它根据X、Y精子DNA含量的差异,借助特异性染色剂染色,然后根据发出的荧光强度测定DNA含量,来分离X、Y精子。英国Cogent公司是世界上第一家将这种精子分离技术应用于奶牛业生产的,该公司目前拥有10台分离仪,每台每小时可分离X、Y精子各1200万个,每台每天按20小时计算可产X、Y精子各2.4亿个。根据母牛人工授精的要求,一般1头母牛1次输精的最低有效精子数不少于700~800万个。由于该仪器的分离效率低,以及经过染色处理精子膜表面的蛋白发生变化,使得受胎率偏低,为此还需进一步改进,才能大规模的商业应用。但分离后的精子可与胚胎移植结合起来,将分离得到的X精子用于超数排卵,生产雌性胚胎;同时,亦可采用单精显微注射技术来控制胚胎性别。
    4.2.2 胚胎的早期性别鉴定。胚胎的性别鉴定需结合胚胎移植技术同时进行。目前最有效的方法是染色体的核型分析和SRY—PCR鉴定法。前者是通过分析少量胚胎细胞染色体的核型来确定性别,此法结果正确,但耗时长,操作复杂,并对胚胎有一定损伤。
    SRY—PCR鉴定法:是利用Y染色体上的雄性特异性片段,通过PCR扩增少量胚胎细胞的特异性基因片段,确定胚胎性别。该法每次测定只需5—8个胚胎细胞,准确率达95%;一般取样后的胚胎鲜胚移植对妊娠无影响,而冻胚的妊娠率下降10%左右。
    4.2.3 LAMP法。最近,日本荣研化学株式会社研制出一种简便、快速、准确的基因扩增方法。其特点是对目标基因的6个区段设定4种引物,利用链置换反应在等温条件下使其发生反应。只要把检样、引物、链置换型DNA聚合酶、基质等放在一定的保温(65℃左右)条件下,一步完成整个检测过程,全过程只需40分钟,反应物呈现白色沉淀,肉眼观察即可。同时,由于采用了雄性特异性以及雌雄共有的核酸序列的引物来进行扩增反,检出的正确率高,该方法即将应用于奶牛胚胎的性别鉴定。
    4.3 克隆技术
    哺乳动物的克隆技术亦称无性繁殖,主要包括胚胎分割和核移植技术两部分。根据细胞核的来源,又将核移植分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植,通称胚胎克隆和体细胞克隆。
    4.3.1 胚胎分割。哺乳动物的胚胎分割是通过显微操作技术,将胚胎一分为二,一分为四,甚至更多,从而获得同卵双生或四生的一项生物技术。胚胎分割技术的应用,不仅增加了优秀遗传特性的个体;而且还可将同卵双生后代用于各种对照试验,它能最高限度的排除个体间遗传差异所造成的影响。
    自上个世纪八十年代以来,哺乳动物的胚胎分割技术发展很快,简化了操作程序,进入了实用化阶段。我国这项技术的研究进展很快,从1987年以来,分别在兔(1987)、山羊(1989)、绵羊(1987)、奶牛(1989)、猪(1995)等取得成功。并于1990年郭志勤等取得绵羊鲜胚四分胚同卵三生,谭丽玲、窦忠英等(1992)分别取得奶牛鲜胚四分胚移植成功,此后冻胚分割和半胚冷冻技术也纷纷过关。目前,胚胎分割作为胚胎移植和胚胎性别的鉴定技术的辅助技术,已具备大面积推广应用条件,具有广阔的产业化前景。
    4.3.2 胚胎克隆。胚胎克隆是通过显微操作技术,将早期的胚胎细胞移入去核的卵母细胞中,构成新合子的生物技术。因此,同一个胚胎提供的细胞核所产生的后代,具有基本相同的遗传性状,称为克隆动物。
胚胎克隆是在胚胎分割基础上发展起来的一项胚胎工程技术,能大量生产基本同质的后代。该项技术在美国已经进入商业化服务,克隆胚胎可以冷冻保存,冻胚解冻后可再克隆产出同质后代。我国在山羊(1991)、兔(1990、1991)、牛(1995、1996)均有研究报道,并获得胚胎克隆或再可隆后代。
    胚胎技术不仅可以生产大量优质母畜的后代,而且可以与其它生物技术结合起来应用。如进行性别鉴别后胚胎的克隆、生产高表达转基因动物和用于保护稀有、濒危动物资源。
    4.3.3 体细胞克隆。自1997年“多莉”羊诞生以来,全世界生物技术界掀起了研究克隆动物的高潮,各国科学家纷纷将研究和取得克隆动物作为一种时尚。试验动物也分别从羊、牛等家畜到经济动物。体细胞核由乳腺细胞、性腺细胞,发展到皮肤成纤维细胞。1998年日本、1999年美国康乃迪克大学在杨向中教授的指导下,用成纤维细胞成功获得日本的克隆和牛和荷斯坦牛。此后,在我国山东、新疆、北京等地也纷纷获得成功。
    体细胞克隆实际是用体细胞核替代胚胎细胞核,其基本技术操作,两者无太大差别。而“多莉”成功的主要贡献是提出了,体细胞经血清饥饿,使细胞处于休止的G0期,再经细胞重组、电融合、激活等技术,获得克隆胚胎,经移植后发育为一个新的动物个体。
    “多莉”的诞生是上个世纪生物技术的重大突破,是生物技术领域的又一个里程碑,它将对生命科学的发展起到无法估量的作用。但是就当前克隆技术的研究情况来看,克隆动物的成功率很低,成本很高,还有很多技术、理论和伦理问题有待解决。至今为止,克隆动物与常规繁殖的动物相比,尚存在成活率低,以及在成长过程中对疾病的抵抗力差等缺陷。同时,使用克隆技术繁殖动物,意味着将失去动物基因的多样性,以至一种小小的疾病,都可以导致群体的毁灭。所以,动物克隆技术的应用还有很长的路要走;但作为今后生命科学研究和生物技术产业化的一种手段,它的发展前景是无法估量的。